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PCR

來源:萬物生物   發(fā)布時間:2021-11-02

PCR

一、實驗原理

PCR 全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文:Polymerase chain reaction),是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),其特點是可以以微量的DNA為模板,快速擴增得到大量拷貝。原理是基于DNA 半保留復(fù)制與堿基互補配對原則,是在體外模擬DNA的天然復(fù)制過程,主要由‘變性-退火-延伸’這三個基本步驟構(gòu)成,變性:DNA雙鏈在高溫條件(95℃)下解旋形成單鏈;退火:降低溫度可使引物結(jié)合到單鏈DNA上,DNA聚合酶結(jié)合到引物上;延伸:DNA 聚合酶在其最適反應(yīng)溫度(72℃)開始沿著DNA5'-3' 方向合成互補鏈。隨著PCR 的進行,生成的DNA本身將作為模板,從而啟動鏈?zhǔn)椒磻?yīng),原始DNA模板被指數(shù)擴增。

 二、實驗試劑

Taq酶,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,dNTPs, DEPC處理水,雙蒸水

 三、實驗儀器

電泳儀, PCR儀,高速離心機,移液器,電泳儀,電泳槽,紫外分析儀

 四、操作步驟

1cDNA的合成

逆轉(zhuǎn)錄體系的組成:

2PCR擴增特異性片段

25ul PCR體系的組成:

五、實驗注意事項

整個操作始終注意避免RNA酶的污染;

PCR反應(yīng)靈敏,注意避免試劑污染;

酶易失活,整個操作注意在冰上進行。

設(shè)立對照:陽性對照:陽性模板,陰性對照:陰性模板,試劑對照:除模板外的所有組分。




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